由于以人为对象进行胰岛素敏感性(IS)的研究受到较大的限制。因此，通过改变实验条件诱发动物IS改变，建立相应的动物模型已成为IS研究的重要方法。有证据表明摄食量与成分的变化可以导致机体血浆胰岛素水平及IS的变化，如由于饮食原因引起单纯性肥胖时出现的IR，以及热量限制时出现的胰岛素水平下降等。本研究选择改变饲料摄入量与摄人成分的实验条件，模拟摄食习惯变化对代谢影响的状态，建立了以不同饲料配方与喂饲方式诱导IS改变的大鼠模型。对于IR在体研究具有一定的应用意义。
材料与方法
一、材料
1．实验动物：雄性SD大鼠132只，初始体重(198±14)g，购自中国人民解放军总医院动物实验室。
2．动物饲料：(1)正常基础饲料：普通商用基础块料，购自中国医学科学院实验动物研究所。(2)高脂高能量饲料：在参考文献[5]基础上调整配方，提高脂肪供热量至59%，并相应调整其他成分含量。由中国医学科学院实验动物研究所制备。两种饲料成分及能量对比见表1。
二、实验方法
1．动物分组与饲养：132只雄性SD大鼠分为三组，每组3个时间段，每个时间段用14只大鼠，7只用于钳夹试验，7只用于OGTT和其他检测，每组有2只机动备用。各组大鼠均喂饲6个月，喂饲方式如下：(1)对照组：喂饲普通商用基础块料，自由摄食饮水；(2)肥胖组：喂饲高脂高能量块料，自由摄食饮水,(3)限食组：为从喂饲高脂高能饲料至2个月时分出再喂饲普通商用基础块料，单笼(33cmX22 cmX13 cm)喂养，自由饮水，但限制食量为同龄大鼠每日进食量的60%（约为16 g/d，40%的热卡限制）。每日称量投放的饲料。大鼠每周称体重。三组大鼠在喂饲至2、4、6个月时采用正常血糖一高血浆胰岛素钳夹试验检测IS并进行口服糖耐量试验( oGrrT)，同时检测大鼠体重、内脏体脂重量及空腹血浆胰岛素( FIns)水平。
2．正常血糖一高胰血浆岛素钳夹试验：钳夹试验前一天下午大鼠用14%水合氯醛胶浆进行腹腔内注射麻醉(0.3 ml／l00g体重)。插管术后第二天上午进行钳夹实验，操作过程见参考文献[6]，取最后五次葡萄糖输注速率( GIR)的平均值作为反映大鼠IS的指标。
3．OGTT:大鼠按2g葡萄糖/kg体重计算灌服相当计量的50%葡萄糖水，分别在服糖前及服糖后15、30、60、120 min时从尾部取血测定血糖值。
4．大鼠血标本采集测定及内脏脂肪质量测定：各组OGTT后48 h的大鼠断头处死，肝素抗凝取血，取上清贮存于-80℃冰箱。血浆胰岛素采用放射免疫法测定。取左侧附睾周围的全部脂肪，称其湿重为内脏脂肪质量。
三、统计学处理
所有数据以均数±标准差(r±s)表示，各项结果运用SAS统计软件进行方差分析(ANOVA)。
结 果
一、不同饲料配方及喂饲方式对大鼠体重、内脏脂肪质量的影响
使用不同饲料及采取不同的方式喂饲后，大鼠的外部体态、体重、内脏脂肪质量等方面都有不同程度的变化（表2）。至实验结束时肥胖组大鼠体重显著高于对照组；而限食组大鼠体重显著低于其他各组。限食组大鼠体重与限食前相比减低了28.4%，与同龄对照组、肥胖组相比分别减低了47.9%和52.3%；
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二、不同饲料配方及喂饲方式对大鼠IS的影响
在实验结束时，两种饲料及两种不同喂饲状况大鼠的IS由高到低依次为：限食组>对照组>肥胖组（图1）。对照组大鼠的IS喂饲4个月中无明显变化，但至6个月时下降了52.3% (P<0.01)。肥胖组大鼠2个月时就已出现IS明显下降，并随喂饲时间延长而不断下降，与同龄对照组大鼠相比，2个月、4个月、6个月时分别低了55.O%、59. 5%、58.0% (P<0.01)。与同龄对照组及肥胖组大鼠相比，限食组大鼠IS始终维持在高敏状态(P<0. 01)，实验结束时限食组大鼠IS是肥胖组大鼠的10倍以上。
三、不同饲料配方及喂饲方式对大鼠OGTT结果的影响
不同饲料及喂饲状态的大鼠出现不同的OG-TT结果（图2）。对照组大鼠喂饲2个月、4个月时OGTT结果正常，实验结束时超出正常值范围，表现为糖耐量受损肥胖组大鼠喂饲2个月时服葡萄糖2h后血糖值(2 hPG)已表现为糖耐量受损，实验结束时糖耐量受损程度进一步加重。限食组大鼠OGTT始终维持在正常状态，实验结束时空腹血糖水平(FPG)和2 hPG在各组中最低。
四、不同饲料配方及喂饲方式下大鼠Flns水平
在6个月的喂养过程中，各组大鼠FIns变化见表3。对照组与肥胖组大鼠FIns在喂饲过程中均有增长趋势；肥胖组大鼠FIns的增长趋势较同龄对照组大鼠水平为高，但差异无统计学意义。喂饲过程中，限食组大鼠Flns显著低子其他两组大鼠(P<0.05)。
五、不同饲料配方及喂饲方式模型的成功率
以高血浆胰岛素一正常血糖钳夹试验测定IS的结果与预期结果的吻合率判定本模型制备的成功率。本实验中共58只大鼠实施了钳夹测定，获得了53只大鼠的实测结果(钳夹实验成功率91.4%)，其中仅有2只的钳夹测定结果与该组大鼠试验预期结果方向不一致，模型的成功率达到96.2%。
讨 论
饲料质量和数量与机体代谢状态密切相关，从而影响机体的IS及血浆胰岛素水平，其中饲料质量的影响尤为重要。本研究中使用的高脂高能饲料参考了已发表的配方，在不改变原配方蛋白含量并能加工成固体饲料的原则下，加大了脂肪比例。与普通商用饲料相比，能量高出40.5%；其中57. 9%的热量由脂肪提供，脂肪提供总能量比普通商用饲料的12. 8%提高了3倍。这是导致食用这种饲料大鼠迅速出现体重增加，体脂堆积，IS下降和糖耐量受损的主要原因。以普通商用饲料不加限制的自由进食方式喂养的对照组大鼠，随喂饲时间延长，在大鼠基本完成生长发育之后，也出现了体内脂肪堆积和IS下降，提示在饮食充足、无控制状态的进食情况下，大鼠也会随着时间推移出现体脂积累，肥胖状态发展，并由此造成IS下降等代谢紊乱现象。这点与人的通常情况相似。
高脂高能量饲料喂饲2个月后用自身对照的方式对这组中的部分大鼠用普通商用饲料进行限食，每只每天食量摄入限定为对照组大鼠摄食量的60%左右。限食大鼠一般状态良好，体重明显降低，体脂蓄积明显减少，IS大幅度升高，对糖负荷保持了良好的应对状态。提示适量的减低能量摄入，不仅能维持机体对胰岛素的良好敏感状态，还可以逆转高脂高能量饲料造成的IR，恢复机体对糖负荷的一定承受能力，这与限食可以维持良好生理机能，减低疾病发生的报道相一致。
既往的报道多为高脂饲料喂养或直接静脉输入脂肪类物质诱导的IR动物模型。本研究中使用的2种饲料配方及2种喂饲方法，快速经济易行，成模率高(>90%)，经胰岛素钳夹试验证实可以成功地制备出稳定、可靠的不同IS的大鼠模型。用此模型模拟IS变化的自然过程、研究IS不同状态（降低和升高）的机制和IR的干预措施是完全可行的。目前ATⅡ水平的升高，其中以心肌局部ATⅡ升高更为明显。心肌ATⅡ不仅可由ACE途径生成，还可由糜蛋白酶途径生成。糜蛋白酶是一种糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，仓鼠、狗和人体内的糜蛋白酶属于a-糜蛋白酶，可裂解ATI分子中的Phe8-His9肽键而生成ATⅡ，多项体内和体外研究均证实，糜蛋白酶在冠状动脉粥样硬化、心室肥厚、心肌纤维化的发生、发展中起重要作用。本实验发现，糖尿病仓鼠心肌局部糜蛋白酶mRNA表达显著升高，而ACE mRNA表达无显著变化，提示心肌局部升高的ATⅡ可能来源于糜蛋白酶途径。与本实验的研究结果相似，Shiota等发现，两肾一夹(2KIC)仓鼠心肌纤维化的发生是糜蛋白酶活化的结果，而与ACE无关。
研究还发现，糜蛋白酶还可通过促进心肌局部炎症反应的发生和心肌局部基质金属蛋白酶(MMPs) c10]的活化而加重心肌纤维化的发生和心肌病变的进程，这可能也是糜蛋白酶参与糖尿病心肌病变发生的机制之一。
总之，本实验通过腹腔注射STZ成功诱导了糖尿病心肌病变仓鼠动物模型，并发现糖尿病心肌病变时伴有心肌局部ATⅡ水平的增高和糜蛋白酶基因表达的增强，提示糜蛋白酶可能参与糖尿病心肌病变的发生和发展，抑制糜蛋白酶的表达或活性可能具有治疗作用。
